GINOP 2.3.2-15-00052

A projekt címe: Az erdészeti kártevő Armillaria (tuskógomba) nemzetség patológiájának és a biológiai védekezés lehetőségeinek vizsgálata
Projekt azonosító száma: GINOP 2.3.2-15-00052
Kedvezményezett: Nyugat-magyarországi Egyetem (9400 Sopron, Bajcsy-Zsilinszky u. 4.)
Támogatás összege: 269 883 102,- Ft

Projektmenedzsment
Szakmai vezető: Dr. Sipos György
Pénzügyi vezető: Brazsil Márti
Elérhetőség:
email: gysipos@emk.nyme.hu
Közreműködő Szervezet: Nemzetgazdasági Minisztérium
A projekt megvalósításának kezdete: 2017.01.01.
A projekt megvalósításának vége: 2020.12.31.
A projekt összefoglalója:
A) Az Armillaria fajok az erdők természetes talajlakó társalkotói, egyes telepeik a Föld felszínének legnagyobb és leghosszabb életkorú élőlényei. A fehér rothadást okozó gombák közé tartoznak, melyek a növényi sejtfal minden nagy molekulájú összetevőjét képesek lebontani, így alapvető szerepet játszanak a szárazföldi élethez szükséges tápanyagok természetes körforgásának biztosításában (Hetala:Forests,6,3304,2015). Egyes Armillaria fajok viszont a legsúlyosabb erdőkárosító gombák közé tartoznak. Megtámadják és elpusztítják az ellenállóképességükben gyengülő fákat, majd a gazdanövény elhalása után teljesen lebontják a fa szöveteit (Baumgartner:Mol. Plant Pathol., 12,515,2011). Az elmúlt évben az Armillaria fajok szerepe a Keszthelyi-hegység erdeinek pusztulásában is felmerült. A kártételükkel szembeni védekezés nehezen kivitelezhető, mert a kórokozó a talajban maradt fás maradványokban sokáig képes életben maradni. A vegyszeres védekezés az erdészetekben számos kedvezőtlen hatással jár, ezért egyre nagyobb igény mutatkozik környezetbarát, biológiai védekezési módszerek iránt. A projekt célja az Armillaria fajok erdészeti károkozó hatásának felmérése, genetikai sajátságaik vizsgálata, és egy biológiai védekezésen alapuló, hatékony erdővédelmi stratégia kidolgozása. Az Armillaria fajok világszerte jelentős erdőpusztulásokat okoznak. Az elérhető teljes genomszekvenciák számának robbanásszerű növekedése mostanra tette lehetővé ennek a komoly gazdasági károkat okozó problémának a genomikai szintű vizsgálatát, a projekt ezáltal rendkívül időszerű, A témát a genomikai megközelítés és az alkalmazni kívánt modern molekuláris biológiai módszerek (RNA-Seq és dual RNA-Seq, kölcsönhatások egysejt-transzkriptomikával történő vizsgálata) az élvonalbeli kutatások közé emelik. A megvalósítani tervezett komparatív genomikai analízis a témakörben világszinten az első, nagy volumenű szisztematikus vizsgálat, melynek eredményeit a tudományos közösségben nagy várakozás övezi, így a tervezett kutatás megteremti a tudományos áttörés lehetőségét. A projekt akadémiai része a törzsgyűjteményben már meglévő a fenyőféléke kolonizáló virulens és szaprotróf Armillaria izolátumok felhasználására épül. 1.-2. év: a két genom funkcionális annotációja és komparatív genomika, rizomorfa és termőtest vizsgálatok, in vitro inváziós kísérletek 2.-3.-4. év: növény-gomba interakciós vizsgálatok A projekt terepi része: 1.-2. év: a károsított erdőkből Armillaria fajok és egyedi telepeik azonosítása, két lombosfákat kolonizáló faj haploid genomjának „PacBio” szekvenálása, genetikai diverzitás meghatározása Illumina szekvenálással, RNA-Seq és az érintett genomok funkcionális annotációja 2.-3. év: Társult mikrobióm minták gyűjtése, törzsizolálás, metagenomika A projekt biokontroll része : 1. év: potenciális biokontroll ágensek tesztelése virulens izolátumokon 2. év: A társult mikrobiómokból izolált mikrobák molekuláris azonosítása, biokontroll képességeik felmérése 3. év: biokontroll ágensek fermentációoptimalizálása 4. év: szabadföldi tesztelés.

B) Kutatási terv 1. Patogén Armillaria fajok és társult mikrobiális közösségeik genetikai vizsgálata súlyosan károsított és természetes állapotú erdőtársulásokban 1.1 Armillaria minták (rizomorfa, micélium, termőtest) gyűjtése Armillaria által súlyosan károsított és természetes állapotú erdőtársulásokból 1.2 Armillaria fajok és nagyobb kiterjedésű egyedi telepeik azonosítása interfertilitási és szomatikus inkompatibilitási tesztek segítségével 1.3 Nagyobb méretű reprezentatív Armillaria egyedek (virulens és nem virulens) kiválasztása, termőhelyi viszonyok vizsgálata, minták gyűjtése az Armillaria rizomorfákkal társult mikrobiális közösségek (mikrobiómok) vizsgálatához 1.4 A társult mikrobiómok baktérium- és gombakomponenseinek izolálása, a mikrobiómot alkotó fajok azonosítása diagnosztikus értékű lokuszok amplifikálása és szekvenálása útján, illetve metagenomikai eszközökkel 1.5 Az izolált baktérium- és gombatörzsek törzsgyűjteménybe (Szeged Microbiology Collection, szmc.hu) helyezése 2. Armillaria fajok patogenitását és virulenciáját meghatározó genetikai faktorok vizsgálata 2.1 Minőségi Armillaria genomok és adatbázisok létrehozása 2.1.1 Két, fenyőféléket kolonizáló Armillaria faj (A. ostoyae és A. cepistipes) közel kromoszómaszinten rendelkezésre álló genomjának teljes értékű annotációja RNA-Seq adatok segítségével 2.1.2 Saját, lombos fákat kolonizáló Armillaria izolátumaink (A. gallica és A. mellea) genomjainak kiegészítő szekvenálása „Illumina”, illetve ahol szükséges, „PacBio” technológiával, a genomok, adatbázisok minőségi továbbfejlesztése 2.1.3 A bioinformatikai munkához szükséges számítógépes háttér és tárolókapacitás kialakítása 2.2 A patogenitási tesztekben felhasznált diploid és haploid Armillaria izolátumok egyedi genetikai hátterének genomszintű meghatározása 2.2.1 A rendelkezésre álló és a terepről izolált törzsek párhuzamos „Illumina” szekvenálása, a genetikai identitás és diverzitás (SNP mintázat) meghatározása 2.2.2 Ismétlődő, nehezen összerakható variábilis szekvenciák esetén a „PacBio” technológia alkalmazása 2.3 Gomba-gazdanövény kölcsönhatások vizsgálata 2.3.1 In vitro kambium inváziós tesztek Friss és autoklávozott faszeletek kambiumába behatoló gomba micéliumszövedékek összehasonlító transzkriptomikai analízise. A kísérletek során tervezzük tesztelni a már meglévő diploid virulens és nem-virulens A. ostoyae izolátumainkat és a károsított erdőkből begyűjtött patogén izolátumokat. 2.3.2 Gazdanövény-gomba interakciós teszt kidolgozása lucfenyő (ismert genom) klónok (lucfenyő-Armillaria patoszisztéma) felhasználásával 2.3.2.1 Armillaria-lucfenyő interakció vizsgálata fénymikroszkópiás módszerekkel 2.3.2.2 Génexpressziós kölcsönhatási mintázatok vizsgálata Armillaria-lucfenyő interakció különböző fázisaiban (dual RNA-Seq) 2.3.2.3 Armillaria-lucfenyő kölcsönhatás vizsgálata a metabolomika és proteomika eszközeivel 3. Az Armillaria patogenitás evolúciós eredetének vizsgálata transzkriptomikai, egysejt-transzkriptomikai és összehasonlító genomikai módszerekkel 3.1 Komparatív genomikai vizsgálatok 3.1.1 Genomevolúciós események rekonstruálása összehasonlító evolúciós genomikai módszerekkel (COMPARE-analízis) 3.1.2 Az Armillaria nemzetségre és az egyes fajokra jellemző genetikai innovációk rekonstruálása, jellemzése funkcionális annotációkkal, egyes kiemelkedő géncsaládok részletes filogenetikai analízise 3.1.3. Növényi sejtfal-biopolimerek lebontásában szerepet játszó CAZy-géncsaládok részletes összehasonlító genomikai analízise 3.2 A rizomorfa ,mint az Armillaria nemzetségre jellemző egyedülálló terjedési és kolonizációs mechanizmus genetikai hátterének feltárása 3.2.1 Génexpressziós mintázatok vizsgálata Armillaria ostoyae C18 törzs rizomorfáinak csúcsi és törzsi zónáiban, összehasonlítva a levegőben terjedő rizomorf csúcsi és törzsi zónáival Armillaria ostoyae C18 törzsben 3.2.2 Génexpressziós mintázatok vizsgálata Armillaria ostoyae C18 törzs termőtesteiben 3.2.3 A rizomorfa- és termőtestképzésben szerepet játszó gének komparatív genomikai analízise, konzerváltságuk, evolúciós eredetük, tartalmazó géncsaládjaik diverzifikációs mintázatainak vizsgálata 3.2.4 Kis szabályozó RNS-ek rizomorfák növekedésében és gyökérkolonizációjában betöltött szerepének vizsgálata 3.2.5 Armillaria-lucfenyő interakció vizsgálata egysejt transzkriptomikai módszerekkel 4. Biokontroll stratégia kidolgozása és gyakorlati tesztelése súlyosan károsított erdészeti területen 4.1 Virulens Armillaria törzsek szelektálása az 1.1. feladat során létrehozott törzsgyűjteményből 4.2 In vitro screenelési módszerek kidolgozása és optimalizálása baktériumok (pl. Bacillus, Pseudomonas fajok) és gombák (pl. Trichoderma fajok) virulens Armillaria fajokkal szembeni antagonizmusának vizsgálatára 4.3 A mikrobiómból az 1.5. feladat során izolált baktériumés gombatörzsek kölcsönhatási vizsgálata virulens Armillaria fajokkal szemben laboratóriumi körülmények között, táptalajlemezeken kivitelezett in vitro antagonizmus- és gátlási tesztekkel, biokontroll index értékek meghatározása, a virulens Armillaria fajokkal szemben jó antagonista képességekkel rendelkező baktériumok és gombák szelektálása 4.4 A szelektált mikroorganizmusok fermentációs előállításának optimalizálása 4.5 In vivo kísérletek a szelektált mikroorganizmusokkal a 2.4 feladat során kidolgozott gazdanövény-gomba interakciós tesztben, metatranszkriptomikai analízis 4.6 A hazai erdőgazdasági kihívásoknak megfelelő mikrobakeverékek összeállítása, készítmény-prototípus létrehozása 4.7 A készítményprototípus szabadföldi tesztelése terepi körülmények között Armillaria-val fertőzött területek talajának új erdőtelepítések előtti remediációjára, ill. erdőtelepítések során a facsemeték kezelésére, alkalmazástechnológiai optimalizálás. A partnerek több évtizedes gyakorlattal rendelkeznek hasonló léptékű hazai és nemzetközi kutatási projektek tervezésében és sikeres megvalósításában, beleértve a szakmai és pénzügyi/adminisztratív feladatok ellátását. A felvázolt kutatási program összhangban van a projekt megvalósításában közreműködő meghatározó kutatók és egyéb résztvevők számával és szakmai kompetenciájával. A pályázatban igényelt támogatás biztosítja a vállalt feladatok tervezett időkereteken belül történő végrehajtását . A projekt szakmai vezetése, illetve a menedzsment a megvalósítást folyamatosan nyomon követve biztosítja a kutatás mérföldköveinek tervezett ütemben történő elérését. A NyME részéről a projektben közreműködő kutatók koordinálják az 1. és 2. feladatok megvalósítását, részt vesznek továbbá a 4. feladat 4.7. részfeladatának megvalósításában . Az MTA részéről Dr. Nagy László koordinálja a 3. feladat megvalósítását. A SZTE részéről a projektben közreműködő kutatók részt vesznek az 1. feladat 1.4. és 1.5. részfeladatának megvalósításában, és koordinálják a 4. feladatban célul kitűzött biokontroll stratégia kidolgozását.

C) A projekt a Nyugat-magyarországi Egyetemen, az SZTE TTIK Mikrobiológiai Tanszékén és az MTA SZBK Lendület Gomba Evolúciós Genomikai Kutatócsoportjában rendelkezésre álló tudásbázisok kutatási tevékenységeinek összehangolása révén magas színvonalú K+F kapacitások kritikus tömegét hozza létre. A projekt egy világszerte súlyos gazdasági károkat okozó erdészeti probléma tanulmányozása révén válik hazai és nemzetközi színtéren egyaránt befolyásoló kutatási programmá, és lehetőséget teremt az erdészeti metagenomika és metatranszkriptomika módszertanának fejlesztésére, továbbá egy erdészeti mikrobiális bioinformatikai kiválósági központ létrehozására. Az Armillaria nemzetség világszerte elterjedt agresszív patogén fajokat foglal magába, genetikai diverzitásuk es patogenitásuk megértésével és az ellenük való védekezési lehetőségekkel népes kutatói közösség foglalkozik. A projekt alapjául szolgáló genomszekvenciák elemzése révén az Armillaria nemzetség első részletes, komparatív genomikai vizsgálata valósul meg, mely mérföldkövet jelenthet a jövőbeli Armillaria kutatások számára. Ezáltal a kialakítandó erdészeti mikrobiális bioinformatikai kiválósági központ nemzetközi szinten is az Armillaria kutatások centrumává válhat. A projekt eredményei rangos nemzetközi folyóiratokban megjelenő publikációk formájában válnak hozzáférhetővé a tudományos közélet szereplői számára, így komoly nemzetközi jelentőségű kutatási elismertség érhető el, oktatási/képzési célú felhasználásuk pedig a tématerületen tevékenykedő fiatal kutatók tudományos fokozatszerzésére biztosított lehetőségek, valamint továbbfejlesztett, a projekt eredményeit is bemutató, kibővített tematikájú egyetemi kurzusok formájában valósul meg. A kutatások a BsC/MsC és PhD képzések rendszerébe a tématerületen tevékenykedő fiatal kutatók tudományos fokozatszerzésére biztosított lehetőségek és az eredményeket integráló, továbbfejlesztett egyetemi kurzusok, a K+F kapacitások megalapozó folyamataiba pedig hazai KKV-kel kialakítandó termékfejlesztési együttműködések révén épülnek be. A fenntartható erdőgazdálkodásból származó faanyag korlátlan ideig újratermelhető, megújuló nyersanyag és széndioxid semleges. A fa- és bútoripar hazai munkahelymegtartó és -teremtő képessége kiszámítható nyersanyag hozzáférést feltételez, amit elsősorban a hazai erdőállományok biztosítanak. A fa- és bútoripari ágazat bázisául szolgáló hazai és közép európai erdőállományokat azonban súlyosan veszélyeztetik a mikrobiális, döntően gombás megbetegedések. Ezek közül is kiemelkednek az Armillaria_ fonalasgomba által okozott fertőzések, amelyek gyakran okoznak tömeges fapusztulást egyes erdészeti területeken, mely egyúttal komoly kihatással van a fa- és bútoripari ágazatra is. Az erdőpusztulás miatt kitermelt rönkfa ipari felhasználása komoly logisztikai kihívás._
A projekt a genomika, transzkriptomika és a biológiai védekezés tudományterületein rendelkezésre álló jelenlegi tudásszinthez képest hazai és nemzetközi viszonylatban egyaránt kiemelkedő jelentőségű, új tudásanyaggal fogja bővíteni a súlyos erdészeti kártevő Armillaria gombanemzetséggel kapcsolatos ismereteinket. A projekt a megvalósítás során felhasználni tervezett legkorszerűbb molekuláris biológiai és bioinformatikai módszerek révén illeszkedik a nemzetközi élvonalbeli kutatásokhoz. A konzorciumi partnerek által a projekt során kialakítandó Stratégiai K+F műhely biztosítja a tudás-infrastruktúra erősítését, a növény-gomba kölcsönhatások vizsgálata területén a legkorszerűbb nemzetközi kutatás-módszertani tapasztalatok hazai adaptációját, valamint a létrehozandó genomikai adatbázisok integrálásának lehetőségét, mely megteremti a nemzetközi kiválósági együttműködésekhez, összehasonlító genomikai projektekhez (pl. 1000 Fungal Genomes Project) történő csatlakozás feltételeit. A Dr. Nagy László projektrésztvevő által kidolgozott komparatív genomikai módszer (COMPARE pipeline) az első olyan metodika, amely lehetőve teszi egy tetszőleges fenotipikus jelleg hátterében álló gének és géncsaladok teljes genomszekvenciák alapján történő szisztematikus azonositását. A projekt keretein belül így a meglévő nemzetközi tudományos együttműködések célzott továbbfejlesztésére és új együttműködések kialakítására egyaránt lehetőség nyílik. A projekt lehetőséget teremt az erdészeti metagenomika és metatranszkriptomika módszertanának fejlesztésére és egy erdészeti mikrobiális bioinformatikai kiválósági központ létrehozására. A projekt feladatainak megvalósítása során a biológiatudomány részterületein elfogadott protokollokhoz illeszkedő korszerű, modern, átfogó kutatási metodológia kerül felhasználásra, mely mikrobiológiai, metabolomikai, fermentációs, molekuláris biológiai, mikroszkópos, bioinformatikai, metagenomikai, komparatív genomikai, transzkriptomikai, új generációs szekvenálási módszereket és terepi vizsgálatokat egyaránt magába foglal, melyek minden szempontból alkalmasak a kitűzött célok eléréséhez. A projektjavaslat megvalósítói szakterületükön sokéves gyakorlati tapasztalattal rendelkeznek a felhasználni tervezett módszerek alkalmazása terén.